En la cromatografía en columna de proteínas se emplean como la fase estacionaria pequeñas cuentas esféricas de celulosa modificada, acrilamida o sílice, cuya supericie típicamente es cubierta con grupos funcionales químicos. Las cuentas están contenidas en un recipiente cilíndrico, o columna, hecho de vidrio, plástico o metal. Estas matrices de fase estacionaria interactúan con las proteínas con base en su carga, hidrofobicidad y propiedades de unión a ligando. Se aplica una mezcla de proteína a la columna y la fase móvil líquida se iltra a través de ella. Pequeñas porciones de la fase móvil o de elución se recolectan a medida que salen (Fig. 1).
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Componentes de un aparato de cromatografía líquida típico. R1 y R2: reservorios del líquido de fase móvil. P: sistema de bombeo programable que contiene dos bombas, 1 y 2, y una cámara de mezcla, M. El sistema puede ajustarse para que bombee líquido desde sólo un reservorio, para que cambie reservorios en algún punto predeterminado a in de generar un gradiente empinado, o para mezclar líquidos desde los dos reservorios en proporciones que varían con el tiempo para crear un gradiente continuo. C: columna de vidrio, metal o plástico que contiene la fase estacionaria. F: recolector de fracción para recolectar porciones, llamadas fracciones, del líquido de elución en tubos de ensayo separados.
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Cromatografía de partición
Las separaciones cromatográicas en columna dependen de la afinidad relativa de diferentes proteínas por una fase estacionaria dada y por la fase móvil. En la cromatografía de partición, la asociación entre cada proteína y la matriz es débil y transitoria. Las proteínas que interactúan de manera más fuerte con la fase estacionaria se retienen más tiempo. El lapso durante el cual una proteína está aso- ciada con la fase estacionaria va en función de la composición de las fases tanto estacionaria como móvil. De este modo, la separación óptima entre la proteína de interés y otras proteínas es alcanzada mediante manipulación cuidadosa de la composición de las dos fases.
Cromatografía de exclusión de tamaño
En la cromatografía de exclusión de tamaño —o filtración en gel— se separan las proteínas con base en su radio de Stokes, el radio de la esfera que ocupan a medida que entran en solución. El radio de Stokes es una función de la masa y la forma moleculares. Una proteína alargada que cae ocupa un mayor volumen que una proteína esférica de la misma masa. En la cromatografía de exclusión de ta- maño se emplean cuentas porosas . Los poros son análogos a irregularidades en una ribera de río. A medida que los objetos se mueven torrente abajo, los que entran en una irregularidad se retrasan hasta que regresan a la corriente principal. De modo similar, las proteínas con radios de Stokes demasiado grandes como para entrar en los poros (proteínas excluidas) permanecen en la fase móvil que está luyendo y salen antes que las que pueden entrar en los poros (proteínas incluidas). Así, las proteínas surgen a partir de una columna de filtración en gel en orden descendente de sus radios de Stokes.
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Cromatografía de exclusión de tamaño. a: una mezcla de moléculas grandes (café) y pequeñas (rojo) se aplica en la parte superior de una columna de iltración de gel. B: al momento de entrar a la columna, las moléculas pequeñas entran a poros en la matriz de fase estacionaria (gris) de la cual se excluyen las moléculas grandes. C: a medida que la fase móvil (azul) luye por la columna, las moléculas grandes, excluidas, luyen dentro de la misma, mientras que las pequeñas, que están protegidas de forma temporal del lujo cuando están dentro de los poros, se quedan cada vez más atrás.
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Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad explota la alta selectividad de casi to- das las proteínas por sus ligandos. Las enzimas pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad usando sustratos, productos, coenzimas o inhibidores inmovilizados. En teoría, sólo se adhieren las proteínas que interactúan con el ligando inmovilizado. A continuación se efectúa elución de las proteínas unidas mediante competencia con ligando soluble o, de manera menos selectiva, al alterar las interacciones entre proteína y ligando usando urea, clorhidrato de guanidina, pH levemente acídico o altas concentraciones de sal. Las matrices de fase estacionaria disponibles en el comercio contienen ligandos como NAD+ o análogos de trifosfato de adenosina (ATP). Entre las matrices de afinidad más potentes y ampliamente aplicables figuran las que se usan para la purificación de proteínas recombinantes modificadas de manera idónea, las cuales incluyen una matriz de Ni2+ que se une a proteínas con una “marca” de poli-histidina ija, así como una matriz de glutatión que se une a una proteína recombinante enlazada a glutatión S-transferasa.
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